Topic outline

  • Úvod do laboratórnych cvičení

    Úvod kurzu je venovaný oboznameniu sa s pravidlami bezpečnosti pri práci v laboratóriu, zasadami bezpečnej práce a prvej pomoci v prípade úrazu v laboratóriu. Študenti podpisujú vstupnú inštruktáž o BOZP. 

    Na každé laboratórne cvičeniesi študenti prinesú:

    preštudovaný návod na lab.cvičenie, laboratórny plášť, zošit, pero,fixy na sklo, kalkulačku. 

    Ostatné pomôcky dostanú priamo na laboratórnom cvičení.


  • Výpočty enzymovej aktivity

    Kurz výpočtu príkladov enzýmovej aktivity vybraných enzýmov z laboratórnych cvičení. Prepočítanie enzymovej aktivity pomocou kalibračných kriviek, pomocou Lambert-Beerovho zákona, počítanie aktivity voľného a imobilizovaného enzýmu, prípadne výpočet straty aktivity po imobilizácii enzýmov. 

    Druhá časť výpočtov je venovaná enzýmovej kinetike reakcií: výpočet maximálnej rýchlosti enzýmovej reakcie, konštanty KM, určovanie typu inhibícii (kompetitívna,nekompetitívna,akompetitívna), výpočet inhibičných konštánt podľa typu inhibície.

    • Stanovenie enzýmovej aktivity invertázy

      Princíp: Invertáza (β–D–fruktofuranozidáza, E.C. 3.2.1.26) je hydrolytický enzým, ktorý štiepi sacharózu. Z jednej molekuly neredukujúcich sacharidov vznikajú dve molekuly redukujúcich cukrov, a to D-glukózy a D-fruktózy.

      Na stanovenie invertázy možno použiť rôzne metódy k stanoveniu vznikajúcich redukujúcich sacharidov alebo polarimetrické metódy založené na zmenách optickej otáčavosti. V uvedenej metóde sa využívajú redukčné vlastnosti reakčných produktov, D-glukózy a D-fruktózy.

      Redukujúce sacharidy v alkalickom prostredí a za zvýšenej teploty vytvárajú s kyselinou 3,5-dinitrosalicylovou (DNS) farebný komplex, ktorého intenzita sa meria pri 540 nm proti slepému pokusu.

      Aktivita invertázy je úmerná množstvu vznikajúcich redukujúcich sacharidov.


      ZADANIE:

      1)    Závislosť enzýmu na koncentrácii substrátu (namiesto 0,5 M roztoku sacharózy sa používajú roztoky s rôznymi koncentráciami substrátu)

       2)    Závislosť aktivity na koncentrácii enzýmu (pri stanovení sa pipetuje roztok invertázy o rôznych koncentráciách. Základný roztok sa riedi pufrom pH 5)

       3)    Závislosť aktivity enzýmu na pH (namiesto fosfátového tlmivého roztoku sa používajú Britton-Robinsonove roztoky s rôznymi hodnotami pH)

      4)    Závislosť aktivity enzýmu na teplote (reakčná zmes s invertázou sa inkubuje pri rôznej teplote).


      • Stanovenie aktivity peroxidázy v rastlinných extraktoch

        Peroxidáza (E.C. 1.11.1.7, Donor : H2O2-oxidoreduktáza) katalyzuje rozklad peroxidu vodíka pričom uvoľnený kyslík oxiduje rôzne zlúčeniny podľa rovnice:

         donor + H2O2 → oxidovaný donor + 2 H2O

             Tento enzým sa nachádza v rastlinách aj živočíchoch, pričom tieto peroxidázy sa navzájom líšia fyzikálno chemickými vlastnosťami. Z rastlín je zastúpená hlavne v chrene, figách, tabakových listoch a obilí, u živočíchov v mlieku (laktoperoxidáza), myelocytoch (myeloperoxidáza), v pečeni, slezine a maternici. U mikroorganizmov sa nachádza u všetkých skupín. Oxiduje rôzne organické zlúčeniny napr.: jednoduché fenoly, hydrochinóny, benzidínové deriváty, guajakol, pyrogalol a ďalšie. V praxi sa využíva rastlinná peroxidáza v analytike pri stanovení glukózy a v enzýmoimunoanalýzach. Laktoperoxidáza sa využíva pri značení bielkovín rádioaktívnym jódom pre rádioimunoanalýzy. Spolu s katalázou sa peroxidáza využíva ako indikátorový enzým správne prevedeného blanšírovania, tepelných zákrokov v konzervárenstve.


        Pracovné úlohy:

        1. Príprava hrubého enzýmového preparátu z vybraných rastlín.
        2. Stanovenie a porovnanie enzýmovej aktivity peroxidázy pripravenej z rôznych rastlinných zdrojov.

        • Spektrofotometrické stanovenie kinetických parametrov (KM, Vmax ) komerčného enzýmu β-galaktozidázy

          Kinetické parametre (KM a Vmax) vypovedajú o špecifickosti daného enzýmu k substrátu i o rýchlosti konverzie a sú pre každú dvojicu enzým-substrát a podmienky (pH, teplota, zloženie) - typické.

          Kinetické parametre komerčných preparátov β-galaktozidázy (izoláty z kvasiniek a vláknitých húb) stanovíme spektrofotometrickým sledovaním kinetiky enzýmovej hydrolytickej reakcie pri rôznych koncentráciách substrátu. Reakčnú rýchlosť pri danej koncentrácií substrátu stanovíme z lineárnej oblasti kinetického priebehu ako smernicu dotyčnice (laboratórne cvičenie predpokladá základnú znalosť biochemického učiva).

          V tomto prípade použijeme ako substrát bezfarebný syntetický analóg laktózy:  2-nitrophenyl-β-D-galaktopyranozid (o-NPG). Enzým β-galaktozidáza hydrolyzuje tento substrát na galaktopyranozid a žlto sfarbený produkt o-nitrophenol (o-NP), ktorý je možné veľmi dobre spektrofotometricky detekovať a po zostavení kalibračnej čiary aj vypočítať jeho koncentráciu v reakčnej zmesi.

                      Z grafického hyperbolického znázornenia rovnice Michaelisa a Mentenovej je zložité určiť KM a Vmax. Preto sa navrhlo niekoľko úprav tejto rovnice, aby závislosť medzi rýchlosťou reakcie a koncentráciou substrátu mala formu priamky. Pre tento typ odporúčame použiť Lineweaver-Burkovu transformáciu.


          • Stanovenie aktivity imobilizovanej β-galaktozidázy

            Pracovné úlohy

            1. Imobilizácia fungálnej β-galaktozidázy do PVA gélu vo forme LentiKats
            2. Stanovenie aktivity voľnej a imobilizovanej fungálnej β-galaktozidázy
            3. Stanovenie optimálneho plnenia reakcnej zmesi imobilizátmi. 
            4. Sledovanie úbytku enzýmovej aktivity fungálnej β-galaktozidázy v priebehu opakovaných reakcií. 
            5. Príprava, analýza, vyhodnotenie vzoriek na HPLC od firmy Agilent. Inštruktáž práce na týchto prístrojoch, hardware a software.
            6. Výpočet úbytku aktivity po imobilizácii enzýmu